MARCADORES
PinB-D1
Este marcador CAPS (secuencia polimórfica escindida amplificada) permite diferenciar una mutación que produce un cambio de secuencia aminoacídica (Gly-Ser) que diferencia al alelo blando PinB-D1a del alelo duro PinB-D1b mediante la digestión con BsrB1 (Gautier et al., 1994) y otra mutación (Leu-Pro) que caracteriza al alelo duro PinB-D1c mediante digestión con PvuII (Lillemo et al., 2000)
En este marcador se obtiene una amplificación de un segmento de 447 pb del gen PinB-D1. Los productos de PCR son digeridos con la enzima de restricción BsrB1, esta enzima reconoce la secuencia de ADN que presenta una mutación que produce un cambio en la secuencia aminoacídica de glicina a serina. Luego de la digestión, un fragmento de 320 pb es esperado en los genotipos que presentan el alelo PinB-D1a (Textura Blanda) mientras que un fragmento de 220 pb es esperado en los genotipos que presentan el alelo PinB-D1b (Textura Dura)
Los productos de PCR digeridos con la enzima BsrB1 son visualizados en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio. La flecha amarilla marca el fragmento de 320 pb perteneciente al alelo PinB-D1a (calles 1 y 4) mientras que la presencia de la banda de 220 (calles 2 y 3) señala la presencia del alelo PinB-D1b. La flecha azul señala el fragmento de 300 pb del marcador de peso molecular de 100 pb (Biodynamics).
Para detectar el alelo Pinb-D1c se emplean los mismos primers que para PinB-D1 y posteriormente se hace digestión con la endonucleasa PvuII cuyo sitio de restricción coincide con la posición 60 del gen de la puroindolina b, donde, en el alelo PinB-D1c ocurre una sustitución de una T por una C que produce el cambio de una leucina por una prolina. Si el alelo PinB-D1c está presente, no ocurre corte y el fragmento amplificado es de 448 pb, por otro lado, si el alelo no es PinB-D1c la enzima de restricción escinde la secuencia en la posición 60 produciendo dos fragmentos de 264 pb y 184 pb (Lillemo et al., 2000, Li et al., 2008, Chen et al., 2013).
Primers (PinB-D1a, PinB-D1b):
PinB-D1-F: 5′- ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA -3′
PinB-D1-R: 5′- TCA CCA GTA ATA GCC ACT AGG GAA -3′
Concentración final de productos utilizados en las reacciones de PCR:
1X Taq buffer (libre de Mg); dNTP: 200 µM c/u; MgCl2: 1.5 mM; primers: 0.2 µM c/u; Taq: 1 U; ADN genómico: 50-100 ng/reacción; Volumen final: 25 µl
Programa de PCR
Desnaturalización: 94 °C, 4 min; Amplificación (40 ciclos); 94 °C 45 seg, 50 °C 45 seg, 72 °C 45 seg; Extensión: 72 °C 15 min
Digestión con la enzima BsrB1
10 µl de producto de PCR fueron incubados durante 2hs a 37 ºC con 5 U de enzima BsrB1.
Primers (PinB-D1c)
PinB-D1-F: 5′- GAG CCT CAA CCC ATC TAT TCA TC -3′
PinB-D1-R: 5’- CAA GGG TGA TTT TAT TCA TAG -3’
Concentración final de productos utilizados en las reacciones de PCR:
1X Taq buffer (libre de Mg); dNTP: 200 µM c/u; MgCl2: 1.5 µM; primers: 0.2 µM c/u; Taq: 1 U; ADN genómico: 100 ng/reacción; Volumen final: 25 µl
Programa de PCR
Desnaturalización: 94°C, 5 min; Amplificación (35 ciclos); 94°C 50 seg, 50°C 50 seg, 72°C 1 min; Extensión: 72°C 10 min
Digestión con la enzima PvuII
30 µl de producto de PCR fueron incubados durante 1h a 37ºC con 2 U de enzima PvuII
Caracterización de la Variabilidad Genética presente en Variedades Argentinas de Trigo.
a = alelo Blando; b = alelo Duro; c = alelo Duro.
Aclaración: Los datos de la caracterización molecular aquí mostrados pueden contener variaciones según el origen de las semillas utilizadas, se recomienda utilizarlos de manera orientativa.
Referencias
- Chen, F., Li, H., & Cui, D. (2013). Discovery, distribution and diversity of Puroindoline-D1 genes in bread wheat from five countries (Triticum aestivum L.). BMC Plant Biology, 13(1), 125. https://doi.org/10.1186/1471-2229-13-125
- Gautier, M.-F., Aleman, M.-E., Guirao, A., Marion, D., & Joudrier, P. (1994). Triticum aestivum puroindolines, two basic cystine-rich seed proteins: cDNA sequence analysis and developmental gene expression. Plant Molecular Biology, 25(1), 43–57. https://doi.org/10.1007/bf00024197
- Li, G., He, Z., Lillemo, M., Sun, Q., & Xia, X. (2008). Molecular characterization of allelic variations at Pina and Pinb loci in Shandong wheat landraces, historical and current cultivars. Journal of Cereal Science, 47(3), 510-517. https://doi.org/10.1016/j.jcs.2007.06.003
- Lillemo, M., & Morris, C. F. (2000). A leucine to proline mutation in puroindoline B is frequently present in hard wheats from Northern Europe. Theoretical and Applied Genetics, 100(7), 1100-1107. https://doi.org/10.1007/s001220051392