MARCADORES
REGIÓN RIP3 DE Vrn-A1
Los trigos invernales requieren una larga exposición a bajas temperaturas (vernalización) para acelerar la floración. Sin embargo, dentro de las variedades consideradas como invernales existe variabilidad en la cantidad de vernalización requerida para saturar la respuesta. Kippes et al. (2018) mostraron que SNP en el sitio de unión de la proteína GRP2 en el primer intrón Vrn-A1 (RIP3) se asocian con diferencias significativas en el tiempo de espigazón después de un tratamiento de vernalización parcial.
El alelo Vrn-A1 salvaje invernal tiene un SNP en la región RIP3 (1_SNP) en relación con la secuencia canónica de RIP3, mientras que el alelo de menor requerimiento de frío tiene tres SNP (3_SNPs). Este efecto se observó utilizando variedades que presentan un copia simple para el gen Vrn-A1 descartándose que la variación en el número de copias del gen fuese la responsable del cambio fenotipico observado.
Las plantas con el haplotipo 3_SNPs mostraron niveles más altos de transcripción Vrn-A1 que aquellas con el haplotipo 1_SNP. El haplotipo 3_SNPs también se asoció con floración temprana en un panel de 127 variedades de trigo invernal cultivadas en tres experimentos separados en ambientes controlados bajo vernalización parcial (36 a 54 días, P <0,001) y un experimento en condiciones de campo (21 días, P < 0.0001).
KASP marker
Los mejoradores de trigo pueden utilizar los polimorfismos RIP3 para desarrollar variedades de trigo de invierno adaptadas a regiones con diferente duración o intensidad de la estación fría.
En Argentina el haplotipo 3_SNPs para RIP3 de Vrn-A1 fue detectado en variedades invernales que presentan bajos requerimientos de frío para espigar (ej. SRN Nogal, DM Algarrobo) y también en variedades primaverales que presentan el alelo Vrn-A1 salvaje invernal para la región del promotor de dicho gen.
Marcador KASP
Primers:
RIP3_A_1SNP_F 3′ GAA GGT CGG AGT CAA CGG ATT TCT CAC AGT CAT TGT TGT TGG TAT G 5′
RIP3_A_3SNPs_F 3′ GAA GGT GAC CAA GTT CAT GCT CTC TCA CAG TCA TTG TTG TTG GTA TC 5′
RIP3_Reverse 3′ AGC AAT CAA GTT GTA ACA TAA ATA ATT A 5′
Concentración final de productos utilizados en las reacciones de PCR:
[Assay Mix]
- Allele-1 primer (100 uM): 12 ul
- Allele-2 primer (100 uM): 12 ul
- Common primer (100 uM): 30 ul
-
H2O/ TrisHCl (10 mM, pH8.3): 46 ul
- (total volume 100 ul)
[KASP reaction]
- DNA (20 – 40 ng/ul): 2 ul
- Assay Mix: 0.14 ul
- 2x Master Mix: 5 ul
-
H2O: 3 ul
- (total volume 10.14 ul)
Programa de PCR
Desnaturalización: 94 °C, 15 min (Hot-start activation); Touchdown (10 ciclos); 94 °C 20 seg, 61-55 °C 60 seg (bajando 0.6 °C por ciclo), Amplificación (36 ciclos); 94 °C 20 seg, 55 °C 60 seg , lectura de fluorescencia 25 °C por 30 seg.
Caracterización de la Variabilidad Genética presente en Variedades Argentinas de Trigo.
Variedades que presentan el alelo w = invernal para Vrn-A1. 1 = Altos requerimientos de frío; 3 = Bajos requerimientos de frío. Se recuerda que se debe observar en conjunto con la variabilidad presente en los genes Vrn-B1 y Vrn-D1.
Aclaración: Los datos de la caracterización molecular aquí mostrados pueden contener variaciones según el origen de las semillas utilizadas, se recomienda utilizarlos de manera orientativa.
Referencias
Kippes, N., Guedira, M., Lin, L., Alvarez, M. A., Brown-Guedira, G. L., & Dubcovsky, J. (2018). Single nucleotide polymorphisms in a regulatory site of VRN-A1 first intron are associated with differences in vernalization requirement in winter wheat. Molecular Genetics and Genomics, 293(5), 1231–1243. https://doi.org/10.1007/s00438-018-1455-0