MARCADORES
FT-D1
Este marcador permite diferenciar la variante alélica tardía, provocada por una deleción puntual de una guanina (G) en el exón 3, del alelo salvaje precoz para el gen FT-D1 (Bonnin et al., 2007).
En base a la mutación descripta por Bonnin et al. (2007), Chen et al. (2010) desarrollaron un marcador de PCR tipo CAPS para detectar el alelo precoz y tardío para el gen FT-D1 (Vrn-D3). Para poder diferenciar los alelos luego de la amplificación por PCR, los productos son digeridos con la enzima de restricción NcoI. El alelo salvaje precoz, sin la deleción, presenta un producto de digestión de 401 pb (punta de flecha verde, calles 1-4, 6-8, 12). Por otro lado, el alelo tardío con la deleción puntual muestra productos de digestión 375 + 27 pb (punta de flecha celeste, calles 5, 9, 10, 12-14).
Los productos de digestión son visualizados en geles de acrilamida al 8% en buffer TBE 1X y teñidos con bromuro de etidio. Las puntas de flechas negras marcan los fragmentos de 500, 400 y 300 pb del marcador de peso molecular 100 pb (Biodynamics).
Primers
VRN-D3-F6: 5’- CTT CTA TTC ACA TGT TTC GTT CAT G -3’
VRN-D3-R8: 5’- ACG AGC ACG AAG CGA TGG ATC GC -3’
Concentración final de productos utilizados en las reacciones de PCR:
1X Taq buffer (libre de Mg); dNTP: 200 µM c/u; MgCl2: 1.5 mM; primers: 0.2 µM c/u; Taq: 1 U; ADN genómico: 50-100 ng/reacción; Volumen final: 25 µl.
Programa de PCR:
Desnaturalización: 94 °C, 5 min; Amplificación (40 ciclos); 94 °C 30 seg, 59 °C 30 seg, 72 °C 45 seg; Extensión: 72 °C 5 min
Digestión
10 µl de producto de PCR, 2 U de enzima (Nco I), 1X de buffer de enzima, 5 µl de ddH20. Digerir 2-3 hs a 37 °C
Caracterización de la Variabilidad Genética presente en Variedades Argentinas de Trigo.
a = sin deleción, alelo funcional; b = con deleción, alelo nulo.
Aclaración: Los datos de la caracterización molecular aquí mostrados pueden contener variaciones según el origen de las semillas utilizadas, se recomienda utilizarlos de manera orientativa.
Referencias
- Bonnin, I., Rousset, M., Madur, D., Sourdille, P., Dupuits, C., Brunel, D., & Goldringer, I. (2007). FT genome A and D polymorphisms are associated with the variation of earliness components in hexaploid wheat. Theoretical and Applied Genetics, 116(3), 383–394. https://doi.org/10.1007/s00122-007-0676-0
- Chen, Y., Carver, B. F., Wang, S., Cao, S., & Yan, L. (2010). Genetic regulation of developmental phases in winter wheat. Molecular Breeding, 26(4), 573–582. https://doi.org/10.1007/s11032-010-9392-6